이하라 토시히데, 일본 국립연구개발법인 산업기술종합연구소

 

환경이나 식품 등의 분야에서 안전·안심 확보를 위해 화학물질 분석이 실시되고 있는데, 법 규제 등의 관점에서 해마다 그 대상이 되는 종류가 증가하고 있는 것이 유해한 유기화합물의 분석이다. 이러한 유기 분석에서 가장 많이 보급되어 있는 분석기기가 크로마토그래프로, 다성분 동시 분석이 가능하다는 우수한 특징을 가지고 있다.

 

그러나 기준에 해당되는 것이 탑재되어 있지 않으므로 측정한 물질 중에 어느 정도 유해 성분이 포함되어 있는지 알기 위해서는 알고 싶은 유해 성분마다 농도와 신호량의 관계를 나타내는 검량선을 작성해야 한다. 이 검량선 작성에 사용되는 것이 표준액이나 표준가스 등의 표준물질로, 환경 분석이나 수도수질 분석 등의 분야에서는 계량법에 근거한 표준액과 표준가스를 신뢰할 수 있는 표준물질로서 널리 보급하고 있다.

 

예를 들면 휘발성 유기화합물 25종 혼합표준액으로는 벤젠이나 클로로포름 등의 유해 성분 25종류가 호칭농도로서 각 1000mg/L로 조제된 것이 시판되고 있으며, 계량법의 체계로 공급되고 있는 표준물질의 증거로서 JCSS(Japan Calibration Service System) 로고 마크가 있는 증명서(모든 성분 농도가 불확실성이 있다고 기재되어 있는 것)가 첨부된다.

 

그림 1에 해당 표준액의 계량 트레이서빌리티 체계를 나타냈는데, 이 그림에 나타나 있듯이 시판되는 실용 표준물질 값(각 성분의 농도)의 신뢰성은 특정 표준물질에서 반복적으로 교정(값 결정)함으로써 보증된다. 해당 표준액에서 특정 표준물질은 벤젠이나 클로로포름 등의 개별 기준물질(고순도 유기 표준물질)의 순도를 바탕으로 유기용매(메탄올)로 희석 혼합함으로써 제조되는데, 기준물질의 값(순도)이 국제단위계(SI)로 거슬러 올라가므로 사용자가 이용하는 실용 표준물질은 세계 공통의 기준으로서 위치가 확보되어 있다.

 

 

그러나 이와 같은 신뢰성 높은 표준물질은 개발에 시간이 걸리기 때문에 만족할 만한 상황이 아니어서 신속한 정비가 요구되어 왔다. 휘발성 유기화합물 25종 혼합표준액에 한정된 것이 아니라, 유기 분석에서 기준으로 이용하는 표준물질의 계량 트레이서빌리티 체계는 비슷한 구조로 되어 있다. 따라서 분석값의 신뢰성을 확보하기 위해 필요한 SI 트레이서블한 표준물질의 정비에는 기점이 되는 고순도 유기 표준물질의 확충이 과제이다.

 

고순도 유기 표준물질의 순도 측정

 

표준액이나 표준가스의 바탕으로 이용되는 고순도 유기 표준물질은 화학물질의 순도가 정해진 것이다. 유통되고 있는 24금과 같이 99.99% 이상의 순도이면, 표준액을 제조할 때 ‘퓨어’한 것으로 취급해도 거의 문제가 되지 않지만, 실제로는 몇 ％의 불순물이 포함되는 경우도 적지 않기 때문에 정확하게 순도가 평가된 고순도 유기 표준물질이 필요하다.

 

그렇다면 고순도 유기 표준물질의 순도는 어떻게 측정되고 있을까? 계량법의 체계로 공급되고 있는 휘발성 유기화합물 25종 혼합표준액에서 특정 표준물질의 바탕으로 되어 있는 25종류의 기준물질(고순도 유기 표준물질) 순도는 모두 응고점 강하법을 핵심 기술로 해서 얻은 것이다. 응고점 강하법은 원리적으로 최고의 계량학적 질을 가진 것으로 알려진 1차 표준측정법 중 하나로, 얻은 값의 신뢰성은 높다고 생각된다.

 

 

그림 2는 휘발성 유기화합물 25종 혼합표준액의 성분 중 하나인 p-크실렌 기준물질의 순도 측정에 적용한 예를 나타낸다. 이 결과는 단열형 열량계를 이용해서 얻은 것으로, 1mK～10mK 정도 온도가 상승하는 에너지를 가해 평형에 이르렀을 때의 온도를 1점씩 측정하므로 극히 작은 불확실성(10ppm～100ppm)으로 순도를 구할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 수 그램의 시료량이 필요하고, 1시료의 측정에 몇 일간이 걸리기 때문에 그림에 나타난 바와 같이 3시료의 측정 결과로부터 순도를 확정하기까지는 2개월～3개월이 필요하다. 또한, 응고점 강하법은 비교적 고순도의 물질(적어도 순도 98% 이상)이 필요하며, 애초에 열분해를 동반하지 않고 융점을 얻을 수 있는 물질에만 적용할 수 있으므로 그 적용 범위는 한정적이다.

 

또한, 1차 표준측정법의 하나인 적정법도 고순도 유기 표준물질의 순도 측정에 이용할 수 있다. 산업기술종합연구소 계량표준종합센터(NMIJ)에서는 17종류의 단백질성 아미노산의 순도 측정에 적정법을 적용해 인증 표준물질로서 공급하고 있다. 그러나 적정법도 중화반응 등 적정 가능한 반응계를 이용할 수 있는 물질에만 적용할 수 있으므로 응고점 강하법과 마찬가지로 적용 범위는 한정적이다.

 

그래서 고순도 유기 표준물질의 순도 측정에 일반적으로 이용되어 온 것이 차수법이다. 고순도 유기 표준물질의 순도 측정에서 차수법은 화학물질에 포함된 휘발 성분, 난휘발 성분, 금속·무기염류, 수분 등을 각각 별도의 장치로 측정해 100%에서 빼는 방법이다(그림 3).

 

 

각 측정의 견고성은 비교적 높지만, 모든 불순물을 빼놓지 않고 측정할 필요가 있기 때문에 시간이 매우 많이 걸리고, 순도에 영향을 주는 함유량의 불순물 성분을 간과하게 되면 정확한 순도를 얻을 수 없다는 단점이 있다. 2010년～2012년에 실시된 알드린(살충제)의 순도 측정을 위한 국제 비교에서 정말로 이 단점이 드러났다. 이 국제 비교는 국제도량형위원회 물질량자문위원회가 주최한 것으로, 각국의 국가계량표준기관들이 참가했다(일본에서는 NMIJ가 참가).

 

간사기관에서 소분한 알드린이 들어있는 작은 병이 참가기관에 배포되고, 그 순도를 보고하도록 되어 있었다. 대부분의 기관은 당시 가장 신뢰할 수 있다고 여겨지는 차수법으로 측정한 순도를 보고했으며, 참가한 19개 기관의 보고값은 그림 4와 같았다.

 

 

참값은 어느 기관도 모르기 때문에 전체 평균값 혹은 중앙값이 합의값(참조값)이 되는 것이 통례이며, 첫 결과 보고에서는 NMIJ가 보고한 결과에서 많이 떨어진 960mg/g 부근이 될 가능성이 시사됐다. NMIJ에서도 차수법이 실시되었기 때문에 상세하게 검증한 결과, 통상적인 분석으로는 검출되기 어려운 폴리머 성분을 대부분의 기관에서 간과했다는 것이 밝혀졌다. 이 점을 지적한 결과, 최종적인 참조값은 950.8mg/g±1.7mg/g이 되어 NMIJ의 값은 참조값과 잘 일치했다.

 

정량 핵자기 공명 분광법의 등장

 

앞에서 말한 것과 같이 차수법은 불순물 성분을 간과하면 올바른 순도를 얻을 수 없다는 단점이 있지만, NMIJ가 큰 실수 없이 자신 있게 보고할 수 있었던 데는 이유가 있었다. NMIJ에서는 차수법 이외에 정량 핵자기 공명 분광법(quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy : qNMR)에 의한 측정(그림 5)도 실시했으며, 양자의 값이 잘 일치하고 있었기 때문이다. 당시 qNMR은 표준물질의 순도 측정에 이용하기 위해 아직 개발 도중에 있던 기술이었다.

 

 

그러나 NMIJ는 세계에 앞서 표준물질의 순도 측정 방법으로 qNMR을 실용화했으며, 측정 정도는 차수법에 비해 조금 떨어지지만 적절한 조건에서 실시하면 신뢰할 수 있는 측정 결과를 얻을 수 있다는 것을 알고 있었다. 그렇기 때문에 국제 비교에서도 차수법과 qNMR의 평균값을 보고한 것이다. 실제로는 NMIJ 이외의 11개 기관에서도 qNMR을 실시하고 있었다. 그러나 나름대로 적절한 값이었음에도 불구하고, 그들 기관의 대부분은 폴리머 성분을 간과하고 있었기 때문에 차수법과 값의 괴리가 생겨서 qNMR을 믿을 수 없었고, 결과적으로 qNMR의 결과를 무시한 것으로 밝혀졌다.

 

그 후에 실시된 순도 측정에 관한 국제 비교에서는 번거로운 차수법을 실시하지 않고 qNMR만을 실시하는 참가기관도 나타나는 등 qNMR은 새로운 순도 측정 기술로서 널리 활용되게 됐다. 최근에는 qNMR을 한층 더 기술적으로 양성하기 위해 연구적인 국제 비교가 제안되었는데, 지금까지 실시된 두 차례의 국제 비교에서 모두 NMIJ가 간사기관을 맡았다. 또한, qNMR을 위한 정량의 기준으로 이용하는 표준물질도 몇 가지 개발됐으며, 국제도량형국의 웹사이트에 대표적인 표준물질이 화학 시프트나 각종 용매에 대한 용해성 데이터와 함께 소개되어 있다.

 

 

qNMR에 의한 표준물질의 순도 및 농도 측정

 

2003년에 개정(2006년에 시행)된 식품위생법의 포지티브 리스트 제도에 의해 모든 농약 등에 대해 일정량을 초과해 잔류하는 식품의 판매를 금지하게 됐으며, 전 세계에서는 700종류가 넘는 농약 등이 그 대상이 됐다. 2007년 시점에서는 SI에 대한 트레이서빌리티가 보증되는 해당 분야의 고순도 유기 표준물질은 일본의 경우, 겨우 2종류에 지나지 않았기 때문에 그 확충이 매우 중요한 과제였다.

 

가능한 한 신속한 표준물질의 정비가 NMIJ에 요구되었으므로 시간이 걸리는 차수법은 적용하지 않고, 시차주사 열량계를 이용한 간이적인 응고점 강하법(단열형 열량계를 이용한 정적인 측정이 아니기 때문에 측정 시간은 대폭 단축되지만, 수백 ppm의 불확실성이 된다)과 qNMR을 적용해 SI에 대한 트레이서빌리티를 확보하기로 했다.

 

그 결과 2008년부터 6년간 144종류의 농약류 표준물질의 값을 정하는 데 성공하고(그림 6), 검역소에서 상시 모니터링하고 있다고 알려진 농약 200종류의 70% 이상을 커버할 수 있는 성과를 얻는 등 식품의 안전성 향상에 공헌할 수 있었다(값이 정해진 표준물질은 시약 메이커에서 공급). 이 때 응고점 강하법으로는 적용하기 어려웠던 농약류가 60% 정도 있었던 반면, qNMR은 대부분의 물질에 적용할 수 있었으므로 qNMR에는 높은 범용성이 있다는 것이 실증됐다.

 

그 후, qNMR의 신속성과 범용성을 활용해 22종류의 비단백질성 아미노산류와 5종류의 아실카르니틴에 적용되는 등, 고순도 유기 표준물질의 SI 트레이서블한 순도 측정 방법으로서 NMIJ에서는 착실하게 실용화가 도모되어 왔다.

 

나아가 2017년에 일본의 설사성 패독 검사 방법이 마우스를 사용한 독성시험에서 기기분석법으로 변경됨에 따라 검량선 작성용 표준액(오카다산 표준액 및 디노피시스톡신1 표준액)이 인증 표준물질로서 NMIJ에서 개발됐는데, 용매인 메탄올을 중수소화 용매로 치환하는 연구를 실시해 표준액의 원액 중 성분의 농도 측정에 qNMR이 활용됐다(qNMR에 의한 측정은 NMIJ, 수산종합연구센터 중앙수산연구소 및 일본식품분석센터에서 실시).

 

qNMR과 크로마토그래피의 조합에 의한 유기 표준액의 농도 측정

 

수질 기준에 관한 후생노동성령의 규정에 근거해 후생노동대신이 정하는 방법(이하 ‘수도수질 검사 방법’)은 정해진 절차에 따라 측정자가 고순도 시약으로 표준액을 조제하도록 되어 있었는데, 그 절차가 번거롭기 때문에 계량 트레이서빌리티가 보증된 표준액의 공급이 수도사업체 등으로부터 요구되고 있었다. 그래서 2015년에 수도수질 검사 방법의 개정이 이루어져 계량법의 규정에 근거한 시판 표준액을 이용할 수 있게 됐다.

 

수도수질 검사 방법에서 요구되는 표준액의 계량 트레이서빌리티를 그림 1에 나타낸 휘발성 유기화합물 25종 혼합표준액과 유사한 구조로 구축하는 것을 가정하면, 성분별 고순도 유기 표준물질의 개발이 필요할 것으로 생각됐다. 그러나 해당 검사에 이용하기 위해 정비를 실시하기로 한 페놀류 6종 혼합표준액에서는 페놀류의 흡습성이 매우 높다는 점과 용매가 되는 아세톤의 휘발성이 높다는 점 때문에 순도를 정한 6종류의 고순도 유기 표준물질로부터 희석 혼합에 의해 정확한 성분 농도의 특정 표준물질을 제조하는 것은 곤란하다고 생각됐다. 따라서 특정 표준물질이 되는 페놀류 6종 혼합표준액의 성분 농도를 직접 측정해 SI에 대한 트레이서빌리티를 확보하기로 했다.

 

이때 고안된 것이 qNMR과 가스 크로마토그래피를 조합하는 농도 측정 방법(이하, ‘qNMR/GC’)이다. 이 방법은 이미 순도를 알고 있는 물질을 기준물질로서 일정량 더함으로써 각 성분의 피크 면적과 기준물질 피크 면적의 비율로부터 각 성분 농도의 SI에 대한 트레이서빌리티를 실현하려고 하는 방법이다. 예를 들면 페놀류 6종 혼합표준액에서는 수소염 이온화 검출에 의한 가스 크로마토그래피(이하 ‘GC’)가 이용되고 있으며, 6종류의 성분을 서로 분리·검출할 수 있다.

 

그림 7에 나타냈듯이 여기에 6종류의 페놀류와 용출 시간이 겹치지 않는 이미 순도를 알고 있는 물질을 기준물질로서 일정량을 더함으로써 각 성분의 피크 면적과 기준물질 피크 면적의 비(이하 ‘GC 응답비’)를 얻을 수 있다.

 

 

GC 응답비는 수소염 이온화 검출기의 특성에 의존하고 있으며, 분자 내에 포함된 탄소수와 비교적 양호한 상관관계가 있다고 알려져 있는데, 엄밀하게는 탄소수에 비례한 응답을 나타내는 것은 아니기 때문에 qNMR과 같은 SI 트레이서블한 측정 결과는 얻을 수 없다. 그래서 미리 2성분 혼합용액(각 성분과 기준물질을 중아세톤에 녹인 것)을 6종류 작성하고, GC와 qNMR로 각각 측정함으로써 GC 응답비와 qNMR로부터 얻은 물질량비의 관계성을 나타내는 상대 몰 감도(이하, ‘RMS’)를 얻음으로써 GC 응답비를 물질량비와 연관시켜 둔다(GC 응답비=물질량비×RMS, 그림 7의 그래프 참조). 얻은 RMS를 이용함으로써 페놀류 6종 혼합표준액으로 얻을 수 있는 각각의 GC 응답비는 물질량비로 변환할 수 있게 되고, 기준물질의 순도를 바탕으로 해 각 성분의 SI 트레이서블한 농도를 이끌어낼 수 있다.

 

NMR 단독으로는 6종류의 페놀류를 서로 분리할 수 없기 때문에 페놀류 6종 혼합표준액의 농도를 qNMR로 직접 얻는 것은 불가능하지만, GC로는 6종류의 페놀류를 서로 분리할 수 있기 때문에 미리 각 성분과 기준물질의 RMS를 구함으로써 GC 응답비를 물질량비와 관련지어 표준액에 정량적으로 더한 기준물질의 순도를 통해 SI에 대한 트레이서빌리티를 실현한다는 개념을 도입한 새로운 분석법이다. 이것에 의해 휘발성 25종 혼합표준액과 같이 성분마다의 기준물질이 필요 없어지고, 또한 천칭을 이용한 정확한 표준액 조제가 불필요해져 신속하고 저코스트의 표준액 정비가 가능해졌다.

 

그 후에 개발한 할로아세트산 4종 혼합표준액이나 헵타옥시에틸렌도데실에테르 표준액에서는 특정 표준물질의 값 결정에 qNMR/GC와 동일한 원리에 근거한 측정 방법으로서 qNMR과 고속 액체 크로마토그래피를 조합하는 농도 측정 방법(이하, ‘qNMR/LC’)이 이용됐다(단, 할로아세트산 4종 혼합표준액에 포함된 성분 중 하나인 트리클로로아세트산은 비교환성 1H를 가지고 있지 않기 때문에 다른 값 결정 방법에 의한다).

 

또한, 헵타옥시에틸렌도데실에테르 표준액에서는 qNMR 측정에 제공할 수 있는 품질의 시약(헵타옥시에틸렌도데실에테르)을 구하기 어려웠기 때문에 분취 LC에 의해 고순도화된 시약으로 RMS를 구하는 방법을 병용한 qNMR/LC를 실시했다.

 

qNMR/GC 및 qNMR/LC는 새로운 표준액 정비에 있어 문제가 되는 고순도 유기 표준물질의 개발이 필요없다는 장점이 있다. 이들 새로운 측정 기술의 적극적 도입 등에 의해 수도수질 기준 8항목에 대응하는 유기 표준액의 정비를 4년이라는 짧은 기간에 달성했다.

 

헵타옥시에틸렌도데실에테르 표준액의 개발로 고안한 분취 LC에 의해 고순도화된 시약으로 RMS를 구하는 방법을 병용한 qNMR/LC는 시약 중의 불순물이나 이성체 등의 영향으로 qNMR 측정을 적절하게 실시할 수 없는 경우에 유용하며, 도핑검사의 검량선 작성에 이용하는 인증 표준물질로서 NMIJ가 개발한 4-히드록시클로미펜 표준액 및 3β, 4α-디히드록시-5α-안드로스탄-17-온 표준액에서도 분취 LC를 병용한 q NMR/LC가 적용됐다.

 

qNMR의 향후 전개

 

이 글에서는 qNMR의 실용화에 의해 SI 트레이서블한 유기 표준물질의 신속한 정비가 도모되어 왔다는 것을 NMIJ의 성과를 중심으로 소개했는데, 현재는 각국의 국가계량표준기관뿐만 아니라 시약 메이커 등도 고순도 유기 표준물질 등의 값 결정에 qNMR을 활용하기 시작하고 있다.

 

또한, qNMR은 일본약국방에 일반시험법으로 등재된 것 외에도 정량 핵자기 공명 분광법 통칙(JIS K 0138)으로서 일본산업규격이 됐으며, 나아가 국제표준화도 추진되고 있어 SI 트레이서블한 순도 혹은 농도의 측정 기술로서 표준물질뿐만 아니라 다양한 분야에서 이용이 확대되고 있다.

 

한편, 일본약국방이나 일본산업규격에 기재되어 있는 qNMR은 1H를 측정 핵종으로 한 것이기 때문에 용매에 용해되는 비교환성 1H를 가지는 유기화합물에 대한 적용으로 한정되어 있는데, 19F나 31P 등 다핵 NMR의 정량 기술 실용화 연구도 추진되고 있다. 이러한 핵종에서는 1H와 같이 고가의 중수소화 용매를 이용할 필요가 없기 때문에 범용적인 용매로 희석된 표준액 중의 성분 농도의 값 결정으로 전개하기 쉬운 장점도 가지고 있으며, qNMR의 적용 범위 확대에 의한 SI 트레이서블한 표준물질의 기동적인 정비가 기대된다.